產(chǎn)品簡介

超氧化歧化酶（SOD）能夠催化超氧陰離子（O2?-）歧化，生成過生成過氧化氫(H2O2)和單質(zhì)氧氣(O2)，是一種重要的抗氧化酶。目前有許多間接或者直接測定SOD的方法，其中，其中NBT(氮藍四唑)法由于使用方便而被廣泛使用，但是，NBT法有幾個缺點，例如生成的染料水溶性差，而且會和黃嘌呤氧化酶的還原型發(fā)生反應(yīng)。雖然cytochrome C法也常被用來做SOD檢測，但它和超氧化物反應(yīng)過于劇烈，不能測定低水平的SOD。SOD Assay Kit-WST-1使用了易溶于水的噻唑鹽：WST-1（2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氫-四唑鹽,二鈉鹽），能夠和超氧陰離子反應(yīng)生成水溶性的染料，因此可以簡便地進行SOD的檢測。WST-1與超氧陰離子反應(yīng)的劇烈程度比cytochrome C小70倍；因此，它的檢測靈敏度非常高，并且能夠通過將樣品用buffer稀釋，使背景的吸光度最小化。WST-1不會和黃嘌呤氧化酶的還原型發(fā)生反應(yīng)，因此，能夠檢測SOD100%的抑制率。WST-1被超氧陰離子還原的比率與黃嘌呤氧化酶的活性線性相關(guān)，并且會被SOD所抑制（見下圖）。因此，SOD或者SOD類似物的IC50(50%的抑制濃度)就能用比色法來測定。

圖1. 基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系和WST-1的SOD酶活力檢測原理圖。XO：xanthine oxidase。

  
       目前測定SOD比較先進的方法包括WST-1法和WST-8法，其中WST-8法比WST-1法更加穩(wěn)定、靈敏度更高。本試劑盒采用了目前測定SOD方法中穩(wěn)定性和靈敏度較好的WST-1法。

WST-1的反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物，可以通過單個時間點的吸光度檢測來測定SOD活力，適合高通量篩選研究。同時WST-1法測定SOD酶活力時，最大抑制百分率可以接近100%，并且可以不受一些常見的干擾因素的干擾，使檢測效果比其它的一些常見方法顯著改善。
本試劑盒的性能優(yōu)于同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)。本產(chǎn)品的用途與同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)相同，等量SOD導(dǎo)致的吸光度變化值顯著大于NBT法，線性范圍更寬。本試劑盒提供的SOD樣品制備液能直接裂解細胞，無需勻漿，操作更加便捷。
   本試劑盒的檢測不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細胞和組織樣品中含有內(nèi)源性的過氧化氫，會干擾SOD的檢測。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，能有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。例如，對于SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，標(biāo)準(zhǔn)品中添加高達0.1mM的過氧化氫時，對于檢測結(jié)果仍無顯著影響。本試劑盒可以檢測細胞或組織勻漿液上清、全血、紅細胞抽提物、血清(漿)、胸水、腹水、腎透析液、尿液、紅細胞、白細胞、血小板、心肌培養(yǎng)細胞、腫瘤培養(yǎng)細胞、各種動植物組織細胞級亞細胞等生物樣品中的SOD活力。

試劑盒組份：

注意事項：

1)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時所用的稀釋液應(yīng)盡量與樣品一致。樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時，標(biāo)準(zhǔn)品也宜使用SOD樣品制備液進行稀釋；當(dāng)樣品為血液等無需處理的樣品時，宜使用試劑盒提供的SOD檢測緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

2)酶溶液有時會被分成兩層，因此忽略移液器混合步驟會導(dǎo)致實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。

3)為提高實驗準(zhǔn)確性，建議每個樣品進行復(fù)孔實驗。

4)本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

5)為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法：

1.樣品的準(zhǔn)備： 
a) 細胞樣品的準(zhǔn)備：

對于貼壁細胞，吸凈細胞培養(yǎng)液，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每100萬細胞加入100-200微升的比例加入本試劑盒提供的SOD樣品制備液，適當(dāng)吹打以充分裂解細胞；對于懸浮細胞，600g離心5分鐘收集細胞，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每100萬細胞加入100-200微升的比例加入SOD樣品制備液，適當(dāng)吹打，以充分裂解細胞。4℃約12,000g離心3-5分鐘，取上清作為待測樣品。

b) 組織樣品的準(zhǔn)備：

動物用生理鹽水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，按照每10mg組織加入100微升SOD樣品制備液的比例在4℃或冰浴進行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。4℃約12,000g離心3-5分鐘，取上清作為待測樣品。
      c) 血漿或紅細胞樣品的準(zhǔn)備：

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃ 600g離心10分鐘，移取上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。紅細胞樣品可以參考步驟1a 懸浮細胞樣品的制備方法，或其它不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。
     d) 上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100微克蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。
     e) 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為1:10)上清，通常需要稀釋10-100倍。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，可以-70℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2.試劑盒的準(zhǔn)備工作：
      a) WST-1/酶工作液的配制：按照每個反應(yīng)160μl的體積配制適量的WST-1/酶工作液。均勻混合151μl SOD檢測緩沖液、8uL WST-1和1ul酶溶液，即可配制成160μl WST-1/酶工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配制適量的WST-1/酶工作液。具體配制方法可以參考下表。配制好的WST-1/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。

b) 反應(yīng)啟動工作液的配制：把試劑盒中的反應(yīng)啟動液(40X)融解后混勻，按照每1μl反應(yīng)啟動液(40X)加入39μl SOD檢測緩沖液的比例進行稀釋，混勻后即為反應(yīng)啟動工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配制適量的反應(yīng)啟動工作液。配制好的反應(yīng)啟動工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.樣品測定：
      a) 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動工作液后充分混勻。注意：加入反應(yīng)啟動工作液后反應(yīng)即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動工作液的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對照3。
      b) 37℃孵育30分鐘。說明：孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結(jié)果的一致性，推薦孵育30分鐘。
      c) 在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢赃x擇設(shè)定600nm (或600nm以上，如650nm)作為參比波長(也稱參考波長)，450nm吸光度的讀數(shù)扣除參比波長的吸光度讀數(shù)即可作為實測讀數(shù)。

4.樣品中總SOD活力的計算：
      a) 抑制百分率的計算：
參考如下計算公式計算抑制百分率：
抑制百分率＝[(A空白對照1－A空白對照2)－(A樣品－A空白對照3)]/(A空白對照1－A空白對照2)×100%
如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物，則A空白對照2 = A空白對照3，此時可以把計算公式簡化 為如下形式(簡化時可以不設(shè)置空白對照3)：
抑制百分率 ＝ (A空白對照1－A樣品) / (A空白對照1－A空白對照2) × 100%
如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測樣品。
      b) SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進行適當(dāng)換算。
      c) SOD酶活力的計算：

圖2. 本試劑盒對SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果。圖A縱坐標(biāo)ΔA450為孵育30分鐘后，空白對照1與SOD標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光度差值。SOD酶活力和ΔA450及抑制百分率(圖B)呈非線性關(guān)系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成線性關(guān)系(圖C)。圖中數(shù)據(jù)僅作參考，實際測定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距可能會因具體反應(yīng)條件的不同和上圖有較明顯的差別。

SOD酶活力的計算公式如下：
待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units
例如，當(dāng)抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當(dāng)抑制百分率為60%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。
d.如果樣品為細胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。
附1：SOD酶活力計算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案進行檢測和計算。此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會因為標(biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實際酶活力下降。
附2：SOD酶活力的動力學(xué)檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學(xué)方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3a后可以37℃孵育同時在450nm連續(xù)測定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內(nèi)的吸光度變化的斜率計算出抑制百分率：
抑制百分率＝[(斜率空白對照1－斜率空白對照2)－(斜率樣品－斜率空白對照3)]/(斜率空白對照1－斜率空白對照2)×100%
其余的計算方法同上述非動力學(xué)的計算方法。動力學(xué)方法的檢測和計算更加精確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動力學(xué)方法即可。