Un1Cas12f1 (Cas14a1) CRISPR酶
| 貨號 | 32119-01/32119-03 | 售價（元） | 1300/5500 |
| 規(guī)格 | 100 pmoL/1000 pmoL | CAS號 |
- 產品簡介
- 相關產品
產品信息
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貨號 |
產品名稱 |
規(guī)格 |
價格 |
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32119-01 |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
100 pmoL |
1300 |
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32119-03 |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
1,000 pmoL |
5500 |
產品簡介
Un1Cas12f1(又名 Cas14a1)是一種內切核酸酶，其在 tracrRNA:crRNA(或 sgRNA)的引導下，特異結合并切割靶標 ssDNA，且不受 PAM 位點的限制。此外，Un1Cas12f1 也能以 PAM 依賴的方式特異地剪切靶標雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。與其他 Cas12 蛋白類似，Un1Cas12f1 蛋白同樣擁有針對ssDNA 的反式切割活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，雙鏈或單鏈 DNA 靶標均能激活 Un1Cas12f1 的反式剪切活性，即當 Un1Cas12f1 蛋白與 sgRNA、靶標 DNA 結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。
相比于其他的 Cas 蛋白，Cas12f1 蛋白的分子量普遍較小(400~700AA)，其中 Un1Cas12f1 的分子量約61.5 kD，可用于靶標核酸的分子檢測(詳細信息請參考 PMID: 30337455)。
產品組成
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組分 |
32119-01 (100 pmol) |
32119-03 (1000 pmol) |
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Un1Cas12f1 Nuclease (10 μM) a |
100 pmol |
1000 pmol |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
1 mL |
1 mL |
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Control Target ssDNA and sgRNA (10 μM) b |
5 μL |
5 μL |
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ssDNA Reporter (FAM-BHQ1, 10 μM) c |
5 μL |
5 μL |
a. Un1Cas12f1 Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target ssDNA and sgRNA 應保存于-80℃并避免反復凍融，必須在 6 個月內使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應體系；
c. ssDNA Reporter (FAM-BHQ1)應避光保存，使用時建議取 0.5 μL
保存條件
Control Target ssDNA and sgRNA 于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應體系中，37℃反應條件下，1 min 內切割 1 pmolssDNA 探針所需的 Cas12f 酶量定義為 1 transU。
例：若某批次 Un1Cas12f1 酶的反式切割活性為 0.7 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 Un1Cas12f1酶可在 1 min 內，在上述指定的反應條件下，反式切割 0.7 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU數(shù)值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1. 反式切割實驗
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組分 |
體積 |
終濃度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM Un1Cas12f1 Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM Target DNAd |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實驗目的進行調整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，Un1Cas12f1 Nuclease 可用 1× HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長期保存，請使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋
并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預期反應到達平臺期的時間可參考各批號Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測報告。
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結果
注意事項
1. Cas12f 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12f 在 sgRNA 的引導下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標需帶有 PAM 位點，而 ssDNA 靶標不依賴 PAM 位點。
2. 當 Un1Cas12f1 結合靶標 ssDNA 時，需使用 T7 核酸外切酶對擴增富集生成的靶標 dsDNA 進行處理，且其中一條擴增引物需要采用磷硫?；揎椧源_保 T7 核酸外切酶僅切割其中一條鏈，從而留下ssDNA 靶標鏈以用于 Un1Cas12f1 介導的分子檢測。此外，也可以用非對稱 PCR 的方法進行擴增，以獲得靶標 ssDNA(詳細信息請參考 PMID: 30337455)。
3. Jennifer Doudna 團隊的研究表明，Un1Cas12f1 只能識別和切割 ssDNA 靶標(詳細信息請參考 PMID:30337455)；然而 Virginijus Siksnys 團隊的最新研究成果則證明，Un1Cas12f1 同樣具有 PAM 依賴型dsDNA 靶標的識別和切割能力，且不同 Cas12f 的 PAM 序列稍有不同，但均富含 T(詳細信息請參考PMID: 32246713)。
4. Cas12f 的反式剪切(trans-cleavage)：當 target DNA 存在時，Cas12f/sgRNA 與 target DNA 形成三元復合物(Cas12f/sgRNA/target DNA)，同時，Cas12f 被激發(fā)反式剪切活性，將反應體系中任意序列的單鏈 DNA切碎。
5. 因為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
6. Un1Cas12f1 酶對熱敏感，容易失活，應全程冰上配置反應體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
7. 本產品僅供科研使用。