產(chǎn)品描述

TranscriptMax T7 High Yield RNA Synthesis Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的高效 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。該試劑盒中含有 T7 RNA 聚合酶、反應(yīng)緩沖液、核苷酸混合液等經(jīng)過優(yōu)化的試劑，可以將含有 T7 啟動子的 DNA 模板高效轉(zhuǎn)錄成 RNA。本試劑盒可應(yīng)用于制備 guide RNA、RNA 標(biāo)準(zhǔn)品等。

產(chǎn)品組分

a. Positive Control Template 是陽性對照，可作為轉(zhuǎn)錄模板使用，用來測試體外轉(zhuǎn)錄體系的反應(yīng)效率。在 37℃孵育30 min 條件下，對照轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系生成的轉(zhuǎn)錄 RNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由 NanoDrop 測定。

保存條件

-20℃保存，有效期 1 年。

實驗流程

1.T7 RNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

T7 RNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖如圖 1 所示。

2.DNA 轉(zhuǎn)錄模板類型

2.1 質(zhì)粒模板

帶有 T7 啟動子的質(zhì)?？梢宰鳛檗D(zhuǎn)錄模板，但是質(zhì)粒必須要線性化，可通過限制性核酸內(nèi)切酶或 PCR 擴(kuò)增的方法將質(zhì)粒線性化。質(zhì)粒線性化后，將純化后的產(chǎn)物作為模板，每個反應(yīng)體系建議加入 1 μg 的線性化質(zhì)粒作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

2.2 PCR 產(chǎn)物模板

帶有 T7 啟動子的 PCR 產(chǎn)物可以作為轉(zhuǎn)錄模板。需要通過電泳確定 PCR 產(chǎn)物的特異性和濃度，一般在 20 μL 的體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 2-5 μL 的 PCR 產(chǎn)物作為模板。

2.3 合成的DNA模板

帶有 T7 啟動子的合成 DNA 片段可以作為轉(zhuǎn)錄模板。一般將合成的 T7 oligo 和 T7 oligo 反向互補(bǔ)的模板鏈退火后作為模板，每個反應(yīng)體系建議加入 0.25 μM-1 μM 的退火產(chǎn)物作為模板。

3.體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

3.1 按下表試劑的順序進(jìn)行反應(yīng)體系的配制。

· 請將試劑解凍并完全混勻后再使用。
· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺，而亞精胺與核酸容易形成復(fù)合體沉淀，DNA 轉(zhuǎn)錄模板盡量最后加入到體系中。
· 上述反應(yīng)體系的總體積為 20 μL，可適當(dāng)?shù)缺壤{(diào)整反應(yīng)體系。

3.2 將上述試劑充分混勻，然后短暫離心，在 37℃下孵育 0.5-1 h 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

3.3 37℃孵育結(jié)束后，后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純化推薦使用 Tolo RNAclean Kit (#36201) ，該試劑盒具有徹底去除 DNA 模板殘留，操作簡便等特點。

注意事項

1. 使用質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)錄模板的時候，質(zhì)粒必須要進(jìn)行線性化處理，否則轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物會出現(xiàn)長度大小不一的情況。

2. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著抑制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，導(dǎo)致 RNA 合成量減少。

3. 實驗過程應(yīng)選用無核酸酶的槍頭和離心管。