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NAD-蘋果酸酶(NAD-ME )檢測試劑盒(微量法100T/96S)

貨號 SH0112 售價(元) 816
規(guī)格 100T/96S CAS號
  • 產品簡介
  • 相關產品

貨號

名稱

規(guī)格

SH0112

NAD-蘋果酸酶(NAD-ME )檢測試劑盒(微量法100T/96S)

100管/96樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義:

ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細胞、動物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應,產生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應,是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物ME活性測定較多,已經成為抗氧化研究的熱點。根據輔酶專一性和對底物特異性的不同,可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測定原理:

NAD-ME催化NAD+還原成NADH,在340nm下測定NADH增加速率。

組成:

產品名稱

SH0112-100T/96S

Storage

提取液:

100ml

4℃

試劑一:液體

20ml

4℃

試劑二:液體

10ml

4℃

試劑三:粉劑

1

-20℃

說明書

一份

 

自備儀器和用品:

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 ml石英比色皿和蒸餾水。

樣本的前處理:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(ml)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(ml)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1ml提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至340nm,蒸餾水調零。

2、 檢測工作液的配制:用時在試劑三中加入15ml試劑一和1ml蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

3、 測定前將檢測工作液在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、55μl試劑二和160μl工作液,混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A11min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。

注意:如果ΔA0.005,可將反應時間延長到2分鐘或5分鐘。

NAD-ME計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T = 3617×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T =7.234×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.25×10-4 L;εNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,1 mlT:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V÷V樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V÷V樣總×500) ÷T =14.468×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.25×10-4 L;εNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,1 ml;T:反應時間,1 min;Cpr樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本質量;500:細菌或細胞總數,500萬。

 

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