測定意義：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過程中，通過乙醛酸循環(huán)及其他過程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物。ICL是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。

測定原理：

ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，監(jiān)測340nm吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL活性。

試劑組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：

先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）工作液的配置，將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（2）在試劑四中加入4ml蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、150μl工作液和40μl試劑四，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

ICL活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白中每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1608×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=3.215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白中每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=3216×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=6.25×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。