測(cè)定意義：

4CL是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸輔酶A酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測(cè)定原理：

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，在333nm下測(cè)4-香豆酸CoA生成速率，即可反映4CL活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀40℃預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至333nm，蒸餾水調(diào)零。

準(zhǔn)備96孔UV板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。

2、樣本測(cè)定

（1）在試劑二中加入5ml試劑一充分溶解混勻，置于40℃水浴預(yù)熱10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后24h內(nèi)用完）；

（2）對(duì)照管：在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μl樣本和190μl試劑一，混勻，立即記錄333nm處40℃反應(yīng)30min后的吸光值A1。

（3）測(cè)定管：在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μl樣本和190μl試劑二，混勻，立即記錄333nm處40℃反應(yīng)30min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

4CL活性計(jì)算：

a．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=31.75×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.063×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=63.49×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=63.49×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.127×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。