正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

 FC是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，也是合成腎上腺皮質(zhì)激素、性激素、膽汁酸及維生素D等生理活性物質(zhì)的重要原料。FC濃度可作為脂代謝的指標(biāo)。

測(cè)定原理：

  FC氧化酶催化FC生成△4-膽甾烯酮和H₂O₂，過(guò)氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成紅色醌類(lèi)化合物，在500nm有吸收峰，其顏色深淺與FC含量成正比。

組成：

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1ml×1支，濃度為0.5 μ mol/ml，4℃保存

自備儀器和用品：

  可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1ml玻璃比色皿、異丙醇和蒸餾水。

FC的提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：先收集400-500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，加1ml試劑一，超聲波破碎1min（強(qiáng)度20％，超聲2s，停1s），即FC待測(cè)液。

3．血清（漿）樣品：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到500 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.FC工作液的配制：臨用前，吸取約0.8ml試劑二分別加入試劑三和試劑四瓶中，充分溶解后再全部轉(zhuǎn)移回試劑二瓶中，充分混勻，FC工作液置于37℃水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：依次在1ml玻璃比色皿中加入100μl FC標(biāo)準(zhǔn)液和900μl FC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測(cè)定A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：依次在1ml玻璃比色皿中加入100μl FC待測(cè)液和900μl FC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測(cè)定A測(cè)定管。

5、空白管：依次在1ml玻璃比色皿中加入100μl 試劑一和900μl FC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測(cè)定A測(cè)定管。

注意：

1、 標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測(cè)定一次。

2、若測(cè)定管產(chǎn)生白色渾濁，可以將待測(cè)液用異丙醇稀釋2~5倍后測(cè)定，并在最后結(jié)果乘以相應(yīng)倍數(shù)。

計(jì)算公式：

1. 血清（漿）中FC含量計(jì)算：

FC含量（μmol /dL）= C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×100ml

=50×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/ml；100 ml：1dL=100 ml。

2. 組織中FC含量計(jì)算：

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

FC含量（μmol / mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

                       = 0.5×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

FC含量（μmol / g鮮重）= C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

                  = 0.5×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g/ml

3. 細(xì)胞、細(xì)菌中FC含量計(jì)算：

FC含量（μmol /10⁴ cell）= C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷細(xì)菌或細(xì)胞（10⁴ cell /L）

=0.5×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷細(xì)菌或細(xì)胞（10⁴ cell /L）

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/ml。

最低檢出限為1nmol/ml。