正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類(lèi)?；D(zhuǎn)移酶?？赡娴卮呋瘡孽；o酶A將?；D(zhuǎn)移至L-肉毒堿的反應(yīng)，在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸通過(guò)線粒體內(nèi)膜的過(guò)程中起重要作用。

測(cè)定原理：

基于肉堿和脂酰輔酶A在丙二酰輔酶A存在與否的條件下，通過(guò)肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)的作用，產(chǎn)生脂酰肉堿，并釋放出巰基輔酶A(COA-SH)，與Ellman試劑DN-TB反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的TNB。通過(guò)其吸收峰值得變化（412nm），來(lái)定量分析CPT-1的活性。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰、無(wú)水乙醇和蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1ml試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿液于600g，4℃離心5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CPT-1（此步可選做）。

⑤ 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CPT-1測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）在試劑五中加入2ml無(wú)水乙醇，混勻，再加入44ml試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（2）在試劑六中加入2ml蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（3）在1ml玻璃比色皿中加入40μl樣本、880μl試劑五和40μl試劑六，混勻，記錄412nm處20秒時(shí)的初始吸光度A1和2分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

CPT-1活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.3556×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，9.6×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。