測定意義：

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，與糖異生途徑、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機(jī)體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

測定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、無機(jī)磷和NAD，340nm處測定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。

組成：

自備儀器和用品：

分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

組織樣本的前處理:

①總GAPDH酶提?。航ㄗh稱取約0.1g樣本，加入1ml提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體GAPDH酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1ml提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿GAPDH酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中GAPDH酶活性。

建議測定總GAPDH酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理:

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟:

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在試劑三中加入500μL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（3）在1ml石英比色皿中加入30μL樣本、20μL試劑三和950μL工作液，混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，記錄340nm處20s時的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

GAPDH活性計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1072×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每一萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=2.144×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。