測定意義：

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一。APX具有多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質(zhì)、線粒體、過氧化物和乙醛酸體，以及過氧化體和類囊體膜上。APX 催化H₂O₂氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影響到AsA的含量，APX與AsA具有一定的負(fù)相關(guān)性。

測定原理：

APX 催化催化H₂O₂氧化AsA，通過測定AsA氧化速率，來計算得APX活性。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5 ml蒸餾水充分溶解。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計、1ml石英比色皿、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

測定：

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到290nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在25℃中預(yù)熱30min。

3. 依次在1ml石英比色皿中加入100μl上清液、700μl預(yù)熱的試劑一、100μl試劑二和100μl試劑三，迅速混勻后在290nm測定10 s和130 s光吸收A1和A2，△A=A1-A2。

APX活性計算公式：

(1)  按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

=1786×△A÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。

APX(nmol/min/g鮮重 ) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1786×△A ÷W

ε：AsA在290nm處摩爾吸光系數(shù)為2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μl=1×10^-3 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（ml），100μl=0.1 ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時間（min），2min。

注意事項：

配制好的試劑二4℃保存，并且3天內(nèi)使用完。