測(cè)定意義：

測(cè)定對(duì)象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中

常常檢測(cè)血漿、血清、唾液、尿液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。

測(cè)定原理：

DPPH·為穩(wěn)定的自由基 ，溶于甲醇，乙醇等極性溶劑中，在 515nm 處有最大吸收。向

DPPH·溶液中加入抗氧化劑時(shí)，會(huì)發(fā)生脫色反應(yīng)，因此可用吸光度的變化并以 Trolox 作為對(duì)照體系量化抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力。

組成：

提取液使用前預(yù)冷

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、低溫臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、恒溫水浴鍋、冰和蒸餾水。

樣品的制備：

(1) 血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品

血漿（制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝，不宜使用 EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 離心10min，取上清待測(cè)。血清、唾液或尿液樣品直接用于測(cè)定，也可以-80℃凍存（不宜超過(guò)30 d）后再測(cè)定。

(2) 組織樣品

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

(3) 細(xì)胞樣品

按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入1ml 提取液），冰浴超聲波破碎（功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；10000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至515nm。

2、 樣本測(cè)定

注意：空白管只需測(cè)定一次，若 A 測(cè)定小于 0.2，需用提取液稀釋后檢測(cè)。

總抗氧化能力計(jì)算公式：

1、以自由基清除率表示：

DPPH 自由基清除率（％）=（A 空白-A 測(cè)定）÷A 空白×100％

2、以標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量表示：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.7072x - 0.0081   R2 = 0.9977                 x:Trolox 濃度(μmol/ml)

y:吸光值差值△A

單位定義:用從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的抗氧化劑Trolox的量來(lái)表示樣本的DPPH自由基清除能力。

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/g 鮮重）=（△A+0.0081）÷0.7072×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)

=1.414×（△A+0.0081）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/mg prot）=（△A+0.0081）÷0.7072×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr)

=1.414×（△A+0.0081）÷Cpr

(3) 按細(xì)胞計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/10⁴cell）=（△A+0.0081）÷0.7072×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

= 1.414×（△A+0.0081）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（4）按液體體積計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/ml）=（△A+0.0081）÷0.7072

=1.414×（△A+0.0081）

V 樣總：加入提取液體積，1 ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，20μl；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：

樣本蛋白濃度，mg/ml 

注意事項(xiàng)：

1. 盡量避免使用在酸性條件下呈紅色或接近紅色的試劑，否則對(duì)本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生

干擾。

2. 樣品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢劑和 DTT、巰基乙醇等影響氧化還原反

應(yīng)的還原劑。

3. 若液體樣本為堿性，需要用提取液稀釋至酸性后再檢測(cè)。