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深圳大學劉翼振副教授團隊在《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表CRISPR疾病診斷研究論文

具有致病性線粒體DNA (mtDNA)點突變的患者通常會出現(xiàn)致殘性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征,導(dǎo)致嚴重殘疾和過早死亡[1]。至少有1/5000的人口受到mtDNA疾病的影響[2]。線粒體遺傳疾病的單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常存在異質(zhì)性[3],即:野生型和突變型共存。突變異質(zhì)率不同的個體表現(xiàn)出不一樣的臨床癥狀[1]。同質(zhì)的mtDNA突變可以很容易地在血液中檢測到。然而,對于異質(zhì)突變,突變mtDNA的百分比水平因組織而異,并且在同一個體中也可能隨時間而變化(例如,導(dǎo)致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)的m.11778A>G)。因此SNP異質(zhì)率的精確檢測對線粒體遺傳疾病的診斷至關(guān)重要。最近,基于CRISPR的分子診斷技術(shù)因其特異性強、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注[4, 5]。例如,巢式RPA和CRISPR/Cas12a輔助病毒鑒定的多重分析平臺(MAPnavi)被用于快速(< 40分鐘)診斷多種呼吸道病毒[6]。然而,這些單信號輸出方法難以準確診斷mtDNA疾病的異質(zhì)性水平,因為結(jié)果受到樣本中模板總量的影響。與基因組SNP基因分型不同,mtDNA疾病的異質(zhì)性水平診斷需要更準確的SNP豐度定量,這仍然是一個挑戰(zhàn)。

化學與環(huán)境工程學院劉翼振副教授團隊在生物傳感器頂級期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表了題為“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究,2022級化學專業(yè)碩士研究生吳小龍為第一作者,陳勇副研究員和劉翼振副教授為共同通訊作者,深圳大學為唯一通訊單位。

Link:https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676

該研究提出了一種自動化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器(RatioCRISPR),用于準確量化線粒體疾病SNP的異質(zhì)性水平:首先,從mtDNA疾病患者的血液樣本中提取DNA。然后與RPA擴增試劑混合,從樣品孔中加入到芯片。之后,芯片將按照預(yù)設(shè)程序自動運行(圖1a)。而后,采用比率信號輸出的方法,提高了穩(wěn)定性,最大限度地減少了樣品濃度對異質(zhì)性水平檢測的影響,使診斷結(jié)果只與模板中野生型和突變型的相對含量有關(guān)。最終RatioCRISPR實現(xiàn)了在25分鐘內(nèi)同時準確地檢測8個樣品,檢出限(LOD)為15.7 aM。并成功檢測了3種mtDNA點突變(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13個模擬樣本,這些突變導(dǎo)致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)[8],并設(shè)定了異質(zhì)性閾值(60%)來評估疾病風險。這種自動化、精確的生物傳感器在診斷多個SNP,特別是具有異質(zhì)性的SNP具有廣泛的應(yīng)用,為遺傳咨詢、流行病學研究和多種異質(zhì)SNP疾病提供了一個快速、經(jīng)濟、實時的臨床診斷平臺。

 

1 RatioCRISPR用于mtDNA疾病診斷的示意圖

作者提出了一種通用的、自動化的RPA-CRISPR/Cas12a比率測定芯片(RatioCRISPR),用于mtDNA疾病的診斷。作者首次嘗試在基于CRISPR/Cas的生物芯片中引入比值信號輸出方法,實現(xiàn)SNP相對豐度的精確定量。該平臺具有以下優(yōu)點:1)建立比率型信號輸出系統(tǒng)來量化異質(zhì)性水平,使樣品濃度的影響減小。2)集成式封閉芯片設(shè)計,避免氣溶膠污染,實現(xiàn)多路自動化檢測。這種先進、便捷的生物傳感器具有通用性、自動化程度高、準確度高等特點,在診斷多個SNP,特別是具有異質(zhì)性變異的SNP方面具有良好的實用性和市場應(yīng)用前景。

RPA試劑盒及試紙條系列:

貨號

產(chǎn)品

規(guī)格

JY0209

雙靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0201

單靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0307

Tiosbio? CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條

50T

JY0301

CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條

50T

JY0308

Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條(變色龍)

50T

WLB8201KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLE8202KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLN8203KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLRB8204KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLRE8205KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLRN8206KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLB5001

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLN5002

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLR5003

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

WLRB5001

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLRN5002

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLRE5003

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

 

Cas酶系列

貨號

包裝規(guī)格

中文名稱

32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32108-03

1,000 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32118-01

100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32119-01

100 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32104-01

100 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32104-03

1,000 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32116-01

100 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32116-03

1,000 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32106-01

100 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32106-03

1,000 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32110-01

100 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32110-03

1,000 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32101-01

100 pmoL

SpCas9

32101-03

1,000 pmoL

SpCas9

32102-01

100 pmoL

Sp-dCas9

32102-03

1,000 pmoL

Sp-dCas9

32120-01

100 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

32120-03

1,000 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

 

 

 

 

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