鈣離子載體/探針（Calcium Ionophores/Indicators）—————專題

    鈣離子是機(jī)體的重要元素，同時作為細(xì)胞內(nèi)第二信使通過與鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）結(jié)合激活多種蛋白激酶（如腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶、鈣調(diào)蛋白激酶等）及諸多蛋白水解酶和核酸酶，從而參與包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞的許多生命活動中擔(dān)當(dāng)著重要的角色。因此，鈣離子測定在醫(yī)學(xué)實驗研究中有著重要意義。

鈣離子測定技術(shù)得益于兩種近代實驗技術(shù)，一是鈣激活蛋白及熒光指示劑（或稱熒光探針），二是熒光檢測及成像分析，這些技術(shù)的日臻成熟使我們能夠觀察到許多與鈣離子濃度變化有密切關(guān)系的亞細(xì)胞現(xiàn)象。近年來，數(shù)字CCD成像熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、多光子掃描顯微鏡、流式細(xì)胞儀等技術(shù)的發(fā)展，使我們不但能夠精確地測定出鈣離子濃度的變化，還可以得出準(zhǔn)確的亞細(xì)胞水平空間定位。

鈣離子濃度變化是活細(xì)胞接受外界刺激后產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)的重要信息傳遞方式，因此細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）介導(dǎo)的相關(guān)藥物篩選以及其他相關(guān)實驗中非常重要的一種研究手段，該領(lǐng)域中常使用鈣離子熒光探針與鈣離子的特異性結(jié)合來觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度水平的變化，此類探針未結(jié)合Ca2+前幾乎無熒光，結(jié)合Ca2+后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，所顯示光譜可被熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、熒光光譜法以及熒光酶標(biāo)儀等多種方法檢測。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化能觸發(fā)細(xì)胞凋亡，下述兩款鈣離子熒光染料被廣泛使用，它們具有細(xì)胞透性，因此可以染活細(xì)胞。它們與鈣離子結(jié)合后熒光強(qiáng)度大大提高，可用于流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和熒光色譜分析。

 FURA-2是細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）的特異性熒光指示劑，由Grynkiewicz等于1985年合成。它能特異性地與Ca2+結(jié)合，結(jié)合比例為1:1同時發(fā)出熒光，結(jié)合Ca2+后的最大激發(fā)波長從結(jié)合前的380nm移向340nm，其發(fā)射熒光強(qiáng)度與結(jié)合Ca2+的濃度有定量關(guān)系。由于FURA-2是極性大的酸性化合物，無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為此在其負(fù)性基團(tuán)上結(jié)合了乙酰氧甲酯，使其成為FURA-2-AM．既增加了酯溶性又消除了負(fù)電荷，使之容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解成FURA-2后可與胞漿游離Ca2+可逆性結(jié)合。但FURA-2-AM在細(xì)胞外并不能與Ca2+結(jié)合，所以檢測的340nm激發(fā)下的發(fā)射熒光強(qiáng)度可定量的確定胞內(nèi)Ca2+濃度及其動態(tài)變化。

一. FURA-2

Fura-2是由紫外光激發(fā)的，一般用340nm以及380nm處激發(fā)它產(chǎn)生的熒光比值（510 nm處檢測）表示鈣離子的濃度。

        FURA-2的特點

        1) 熒光強(qiáng)度大，敏感度高，且所用劑量小，對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境影響??；

        2) FURA-2測定[Ca2+]基本不受細(xì)胞密度及熒光劑濃度的影響，易于識別與計算；

        3) 對鈣的選擇性高；

        4) 自身熒光??；

        5) FURA-2與Ca2+結(jié)合的解離常數(shù)(Kd) 37℃為224，其標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性，其對Ca2+的測定范圍為10-5～10-82 mol/l，且能測定短暫而快速的Ca濃度的變化。

FURA-2的應(yīng)用：它主要應(yīng)用于兩個方面，一是將FURA-2直接注入單個細(xì)胞內(nèi)，用熒光顯微鏡觀測Ca2+染色；二是測定細(xì)胞懸液、組織塊或貼壁細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

左圖：REF-52成纖維細(xì)胞用FlCRhR處理后，用FURA-2染色。第一行顯示cAMP變化，第二行FURA-2染色顯示CA2+變化。1-4列分別為對照、處理0分鐘、17分鐘和38分鐘的熒光圖象。結(jié)果顯示，胞內(nèi)cAMP誘導(dǎo)的FICRhR C亞基增多（FITC標(biāo)記），但Ca2+濃度變化不大。該文章發(fā)表在Proc Natl Acad Sci USA 93, 4577(1996)。

二.Fluo-4 

Fluo-4 是一種將Fluo-3結(jié)構(gòu)中的Cl替換成F的鈣熒光探針。由于將Cl替換成了電子吸引力更強(qiáng)的F，它的最大激發(fā)波長會向短波長處偏離10 nm左右。這個波長更接近于氬激光器的波長，所以用氬激光器激發(fā)時，Fluo-4的熒光強(qiáng)度比Fluo-3強(qiáng)1倍。由于Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3近似(Fluo-3: Kd=0.4 umol/l、Fluo-4: Kd=0.36 umol/l)，所以使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀等儀器檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。Fluo-4-AM是Fluo-4的一種乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進(jìn)入細(xì)胞中。AM進(jìn)入細(xì)胞后會被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4隨后會和鈣離子結(jié)合并發(fā)出熒光。

上圖是以9秒間隔連續(xù)拍攝而成。該細(xì)胞首先用50 mM KCl去極化處理 (2)，然后用離子載體ionomycin 5 uM處理 (8)。該照片由熒光顯微鏡成像，再由冷CCD拍照而成。后期處理將濃度差異轉(zhuǎn)化為顏色差異，紅色表示高濃度鈣離子，藍(lán)色表示低濃度鈣離子。

常用的Ca2+熒光探針根據(jù)波長的不同，分為兩大類：

第一類：可見光激發(fā)Ca2+熒光探針

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點：

1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細(xì)胞儀等。

2）具有更強(qiáng)的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低了對活細(xì)胞的光毒性。

3）Ca2+依賴性熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。5）無光譜偏移。

介紹幾種最受歡迎的可見光激發(fā)Ca²⁺熒光探針：

1）Fluo-3

Fluo-3是最常用的可見光激發(fā)Ca²⁺熒光探針，較高的Ca²⁺結(jié)合力可捕捉細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺信號的動力學(xué)變化，使用于多種流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)實驗，如籠鎖Ca²⁺螯合劑光活化、第二信使、神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)研究以及細(xì)胞水平的藥物篩選等。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強(qiáng)。但是，當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，熒光會增加60至100倍，最大激發(fā)波長為 506nm，最大發(fā)射波長為 526nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525～530nm?？梢允褂眉す夤簿劢癸@微鏡或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

2）Fluo-4

Fluo-4是鈣指示劑Fluo-3的升級版本，主要變化為后者分子上的兩個氯原子被Fluo-4上的氟所取代，該結(jié)構(gòu)上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測信號更強(qiáng)。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一種可見光激發(fā)的高親和力Ca²⁺指示劑，與其他可見光激發(fā)熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長波長，更適用于檢測具有較高自熒光現(xiàn)象的細(xì)胞和組織內(nèi)鈣離子水平以及檢測由光感受器和籠鎖Ca²⁺螯合劑光激活導(dǎo)致的鈣離子釋放。

圖 Fluorescence emission spectra at equal concentrations of fluo-4 (blue) and fluo-3 (red) in solutions containing 0–39.8 μM free Ca²⁺.

你所不知道的秘密：為什么許多熒光探針會有R-AM或者R的形式提供？以Fluo-4或Fluo-4, AM為例。

常規(guī)的熒光探針如Fluo-4屬極性大的酸性化合物，無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此時，若想做細(xì)胞內(nèi)染色，需要通過膜片微電極（patch pipette），顯微注射（microinjection），胞引作用加載試劑等手段，輔助實現(xiàn)藥物加載，何其麻煩??！

為此，而通過在Fluo-4的負(fù)性基團(tuán)上結(jié)合乙酰氧甲酯（AM），該單一的變化既增加了酯溶性又消除了負(fù)電荷，極大的提高了細(xì)胞滲透性。只需要把細(xì)胞孵育在含藥物的培養(yǎng)液中，即可實現(xiàn)加載，非常省事。而一旦Fluo-4 AM進(jìn)入細(xì)胞后，酯化鈣離子熒光探針被酯酶水解，恢復(fù)Fluo-4，在胞內(nèi)完全發(fā)揮其正常生理功能。

第二類：紫外光激發(fā)Ca²⁺熒光探針

Fura-2和Indo-1均屬可見光激發(fā)Ca²⁺熒光指示劑，也是目前最常用的比率測量熒光探針。與第一代染料Quin-2相比，Fura-2和Indo-1發(fā)出更強(qiáng)的熒光，在生理pH范圍內(nèi)對pH變化不敏感。與Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二價金屬離子相比，對Ca²⁺有更高的選擇性，因此得到了廣泛應(yīng)用，同時作為雙波長熒光染料在標(biāo)定Ca²⁺濃度時不再單純依靠熒光強(qiáng)度的變化。

1）Fura-2

2）Indo-1

Fura-2是雙激發(fā)波長熒光染料，Indo-1是雙發(fā)射波長熒光染料，均采用比率測量方法，該方法可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2特別適合于數(shù)字成像顯微鏡，使用該設(shè)備可更方便的調(diào)整激發(fā)波長，使探針結(jié)合鈣離子后在300-400nm的激發(fā)波長范圍內(nèi)掃描Fura-2的吸收偏移，在510nm處檢測發(fā)射波長。相比之下，Indo-1更傾向于流式細(xì)胞術(shù)檢測，使用該設(shè)備可實現(xiàn)在氬離子激光器的351-364光譜范圍內(nèi)單一波長的激發(fā)，在400nm和480nm的波長處分別檢測結(jié)合鈣離子和未結(jié)合鈣離子的熒光信號，通過二者的比值確定鈣離子的濃度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分別是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活細(xì)膜滲透性。

相關(guān)產(chǎn)品：