共培養(yǎng)遷移實(shí)驗(yàn)--周細(xì)胞與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)遷移試驗(yàn)

      周細(xì)胞生長(zhǎng)在血管內(nèi)皮細(xì)胞外周，能夠輔助血管的成熟。周細(xì)胞的缺失能夠直接影響血管的形成。但在肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension (PAH)）患者肺組織內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)而導(dǎo)致的血管損傷的機(jī)理卻尚未清楚。

      斯坦福的科研人員在研究周細(xì)胞（pericytes）和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）關(guān)系時(shí)，希望能觀測(cè)到周細(xì)胞和PMVECs共培養(yǎng)時(shí)，周細(xì)胞收到PMVECs細(xì)胞的影響而產(chǎn)生的遷移和極化行為。但在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中，研究人員只能發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞對(duì)PMVEC細(xì)胞有一趨化行為。但是無法量化這一趨化行為，也無法研究周細(xì)胞的極性變化。

SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency.

Chen C, Zhu C, Huang J, Zhao X, Deng R, Zhang H, Dou J, Chen Q, Xu M, Yuan H, Wang Y, Yu J.

Nat Commun. 2015 Nov 19;6:8899. doi: 10.1038/ncomms9899

在文中，研究人員使用Ibidi開發(fā)的傷口愈合插件進(jìn)行了這一共培養(yǎng)“傷口愈合”實(shí)驗(yàn)。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養(yǎng)皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將兩種細(xì)胞分別種在插件的兩個(gè)孔中，等待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個(gè)無細(xì)胞的“劃痕”。不僅能夠觀測(cè)到周細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞遷移的行為，而且可以使用細(xì)胞免疫熒光染色的方法，對(duì)周細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架排列進(jìn)行觀測(cè)，確定細(xì)胞的一個(gè)趨化行為。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1) 細(xì)胞：PMVECs   （C-12282，PromoCell）Pericyte

2) 實(shí)驗(yàn)耗材：傷口愈合插件培養(yǎng)皿 (ibidi, 81176)

3) 細(xì)胞培養(yǎng)基：

EC-media   （C-22120， PromoCell）

Pericyte media （ScienCell Research Laboratories）

4) 滅菌鑷子

5) 試劑：

中性粒周蛋白   

鬼筆環(huán)肽       

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1）鋪細(xì)胞（圖二）

將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。

在ibidi細(xì)胞插件的每孔中分別加入1.5 ×10⁴的PMVECs和Pericyte的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。

在37。C培養(yǎng)箱中孵育。

圖二，ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞

2）形成“劃痕”

采用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞16小時(shí)

如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。

圖三，移除插件

移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。

小心的清洗細(xì)胞，之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（圖四）

 三、采集并分析圖像

在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向最好是水平或者垂直。

采集0h和6h的圖像，觀測(cè)細(xì)胞的遷移率和細(xì)胞遷移方向

用中性粒周蛋白定位微管生長(zhǎng)中心（MTOC）并用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-actin

由圖可見，相對(duì)于左側(cè)的對(duì)照，右邊的PAH來源的Pericytes遷移距離較短，并且從熒光標(biāo)記圖上可見，紅色箭頭表示遷移的方向，PAH組無特定方向，不受PMVEC的影響。柱狀圖為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。