1.Q：PKMITO可以染植物細(xì)胞線粒體嗎

A：目前測試了幾種植物樣本，衣藻、花粉管都有成功的案例，根尖細(xì)胞和擬南芥葉片效果都不理想，所以一般不推薦使用PKMITO染料標(biāo)記植物細(xì)胞線粒體。除了帶細(xì)胞壁的樣本存在透膜問題，植物細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜電勢差也比動物細(xì)胞小，所以也可能存在標(biāo)記問題。原生質(zhì)體可以染，但效果一般。

2.Q：維拉帕米的用法

A：對于一些不容易透膜標(biāo)記靶點的染料，在不影響實驗設(shè)計的前提下，我們推薦使用維拉帕米（一種鈣通道阻滯劑）增加染料在細(xì)胞內(nèi)的保留，以提高染色效率，染料是否推薦搭配使用請參考染料的網(wǎng)站介紹或網(wǎng)站產(chǎn)品詳情頁的電子版說明書。

具體用法一般建議是1-10μM的終濃度，在整個染色到拍攝的全過程中都使用，例如在配置染色工作液時即加入適當(dāng)濃度的維拉帕米，然后進(jìn)行孵育染色，在染色結(jié)束如果進(jìn)行進(jìn)一步清洗，那么在清洗后仍然加入適當(dāng)濃度的維拉帕米，以保證長時間拍攝時的穩(wěn)定性。推薦貨號：麥克林 V875827;中國上海

3.Q：線粒體探針染了細(xì)胞，熒光能保留多久

A：在以往的實驗中，用PKMITO染料染完色后，細(xì)胞傳一代基本都還能保留熒光，所以幾天之內(nèi)基本上都有熒光。

4.Q：actin染料和fastact有什么區(qū)別

A：這兩款染料分子上帶的定位基團(tuán)不一樣，fastact系列是迭代的更優(yōu)化的版本，生物相容性更好，細(xì)胞毒性更低。但化學(xué)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化不代表在每種生物樣本中都能帶來優(yōu)化的效果，成像最終效果或許沒有質(zhì)的差別。

5.Q：spirochrome的染料能不能用在植物或者海洋生物中

A：膜張力探針可以用在植物細(xì)胞上，其他染料不能。Tag類的染料可以標(biāo)記，但需要轉(zhuǎn)染表達(dá)的操作。“All our probes do not work in live plants and whole marine organisms (e.g. sea urchin embryos, jellyfish, sea star, etc) with the exception of Flipper-TR, which has been shown to work in plants.It seems the probe do not penetrate into the cells due to additional barriers (e.g. cell wall)”

6.Q：PKZinc系列幾種染料的區(qū)別

A：PKZnR-5的親和力最強(qiáng) 信噪比也最高 所以檢測信號的效果最好；換句話說1能做的實驗5理論上都能做的更好，R1-R5本質(zhì)區(qū)別就是親和力，R1 FR1/2/3的親和力都一樣 都比R5低不少。

7.Q：幾款線粒體染料有什么區(qū)別

A：PKMITO系列四款產(chǎn)品：前三個是活細(xì)胞染料，是最好用熱度最高的，它們有兩個區(qū)別：一是激發(fā)通道不同，成像質(zhì)量都一樣，是超分辨水平的染料，抗淬滅、低光毒性；二是orange這款更適合做STED成像，另外兩個通道不適合拍STED；第四款帶FIX后綴的是可固定版本染料，也需要活細(xì)胞染色，染完后可以固定，但是這款染色沒有活細(xì)胞染料易用，對技術(shù)要求更高一些，摸條件的難度更高。

PK Mito Orange Fix這款染料的使用難度大，不適合做超分辨比較少的用戶，它的透膜效率在一些細(xì)胞種類上較低，染色條件不好摸，僅照著說明書的話不容易做出來，而且不管哪個角度，固定后的線粒體，成像效果是不如活細(xì)胞的，因為不管怎么固定，線粒體肯定都會有損傷，所以這款染料只是提供了固定線粒體拍攝的一種解決方案，但并不具有普適性，只適合進(jìn)階玩家或者特殊實驗需求。當(dāng)然我們還在開發(fā)使用更簡單的fix染料，提高fix染料的使用范圍，目前還在研發(fā)過程中。

HBmito這款產(chǎn)品作為線粒體染料的新品，主打遠(yuǎn)紅通道的STED顯微鏡成像場景的應(yīng)用，其作為活細(xì)胞染料的話，成像性能略遜于PKMITO系列，但PKMITO系列不支持遠(yuǎn)紅通道的STED應(yīng)用；而且HBmito是允許固定的，固定后的效果比mitotracker稍好一些，固定后是否能做超分辨，我們還在測試。

8.Q：線粒體染色后背景過高或者線粒體形態(tài)不好有哪些可能，怎么優(yōu)化？

A：背景過高，導(dǎo)致線粒體信號太強(qiáng)看不出來形態(tài)，首先考慮染色濃度太高了，可以將染色濃度降低一些，考慮1：2000或者更低（根據(jù)實際成像結(jié)果或者信號強(qiáng)度判斷），還有不要室溫染色，線粒體本來就是對環(huán)境敏感的細(xì)胞器，除非樣品本身孵育溫度就是室溫，否則要在37℃，其次在染完色后，可以用共聚焦設(shè)備/模式看看染色效果，看一是背景是否過高，二是線粒體形態(tài)是否良好，如果都不錯，清洗1-2次后換上新的預(yù)熱的培養(yǎng)基，再孵育20-30min，這樣線粒體形態(tài)會更好，背景會更低。

超分辨成像是很綜合很注重細(xì)節(jié)的實驗，所謂三分染色七分拍，一定要注意樣本的狀態(tài)是否良好，樣本狀態(tài)對于成像結(jié)果的影響比想象中要大很多，也不必拘泥于說明書步驟，因為實驗影響因素太多，說明書只能提供一些基礎(chǔ)框架，這種操作上的寬容度既是超分辨實驗的的優(yōu)勢也是難點，一定是要參考實際成像效果進(jìn)行條件優(yōu)化的，優(yōu)化的目的是用最少的染料，完成染色標(biāo)記需求，減少各種試劑對細(xì)胞的影響。

9.Q：有沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染料

A：沒有，目前推薦的超分辨標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的方式為轉(zhuǎn)染熒光蛋白（超分辨門檻，適用于SIM顯微鏡并向下兼容）；或者利用蛋白標(biāo)簽技術(shù)如Halo Tag蛋白標(biāo)簽或者SNAP蛋白標(biāo)簽，先利用標(biāo)簽質(zhì)粒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)相應(yīng)的tag，再利用CA或者BG系列產(chǎn)品去標(biāo)記tag，這是一種穩(wěn)定的間接標(biāo)記手段，依賴于我們優(yōu)化的CA/BG系列探針，可達(dá)到穩(wěn)定的超分辨成像效果（適用于STED、SIM顯微鏡并向下兼容）。

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